MTT的應(yīng)用
MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。但是它的缺點也很多，如果操作和數(shù)據(jù)處理方法不當(dāng)，結(jié)果可信度和可重復(fù)性很低。
MTT主要有兩個用途
1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測定；
2.細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測定。
MTT的原理
MTT商品名：噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料。
檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)(如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小)。
MTT工作濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液(PBS)或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm 濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放-20℃避光保存即可。
實驗步驟
1)鋪板，使用96孔板，每孔細(xì)胞密度控制在4000-5000個，體積100μl每孔。
2)5%CO2，37℃孵育，正常4到6小時貼壁后即可,加入濃度梯度的藥物。
3)5%CO2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4)每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
5)終止培養(yǎng)，一次性像潑水一樣，直接潑掉孔中的液體。
6)每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
試劑材料準(zhǔn)備與實驗儀器
1)對數(shù)生長期細(xì)胞
2)受試因素(藥物)
3)MTT：以PBS配制成5mg/ml，抽濾除菌，保存在4?C
4)DMSO(二甲基亞砜)
5)96孔板
6)酶聯(lián)免疫檢測儀
7)細(xì)胞培養(yǎng)箱
常用鋪板方法
灰色為邊緣孔，加入無菌PBS；綠色為空白組，不加細(xì)胞，只加入培養(yǎng)基和MTT。
黃色為對照組，加入細(xì)胞，不加藥；藍(lán)色為實驗組，加入細(xì)胞和藥物。
實驗注意事項
MTT實驗的主要缺點在于如果操作和數(shù)據(jù)處理方法不當(dāng)，結(jié)果可信度和可重復(fù)性很低，以擬合化合物IC50為例介紹操作中注意事項：
1)嚴(yán)格控制鋪板密度和給藥濃度(對結(jié)果影響最大)
96孔板孔徑很小，如果細(xì)胞密度過大，藥物對腫瘤的抑制作用作用越小。同時，收樣前，對照組孔內(nèi)如果已經(jīng)長滿細(xì)胞，就不能模擬出48小時后細(xì)胞的真實數(shù)量，對結(jié)果也有影響。
根據(jù)經(jīng)驗，建議鋪板時每孔細(xì)胞個數(shù)在4000左右，給藥時細(xì)胞密度控制在30%左右。孔底的細(xì)胞一定要均勻分布。
2)注意邊緣效應(yīng)
細(xì)胞培養(yǎng)過程中，邊孔水分蒸發(fā)很快，因此邊孔內(nèi)藥物濃度會濃縮，細(xì)胞狀況會更復(fù)雜。因此鋪板只用中間60孔，邊緣36孔加入無菌PBS。
3)給藥濃度
為擬合IC50，通常設(shè)置10個給藥濃度，每種濃度5個復(fù)孔。收樣時，最高濃度孔內(nèi)細(xì)胞一定要抑制率能夠達(dá)到90以上，并且同時有2個及以上點抑制率都能達(dá)到90%以上。
4)避光操作
MTT一般4度保存兩周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解，配制完后可過濾一下。
5)培養(yǎng)液
貼壁細(xì)胞加MTT前吸掉培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞可以不吸除培養(yǎng)液，再加入 0.5%MTT，量為20ul/孔。
結(jié)果分析
將各孔OD值減去本底OD值(培養(yǎng)基+MTT+DMSO，不含細(xì)胞)或者對照組OD值，各個復(fù)孔取平均值±SD值即為最終結(jié)果。
改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg 最大劑量
I:lg(最大劑量/相臨劑量)
P:陽性反應(yīng)率之和
Pm:最大陽性反應(yīng)率
Pn:最小陽性反應(yīng)率
舉個例子：各藥物濃度作用于某腫瘤細(xì)胞后所得MTT值如下：
公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率
抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值，如對于100ug/ml的藥物，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869，各組抑制率如下：
代入計算公式：
Pm=0.869
Pn=0.135
P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142
Xm=lg100=2
lgI=lg100/50=0.301
lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655
IC50=45.186
該藥物的IC50值為45.186ug/ml
