熒光定量PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)90年代，由于該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)CR反應(yīng)的全過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，并且自動(dòng)化程度高，所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時(shí)間，在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。

熒光定量PCR是實(shí)驗(yàn)室最常用的實(shí)驗(yàn)，熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)隨著PCR反應(yīng)的積累來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并通過(guò)分析軟件對(duì)PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析的技術(shù)。

 熒光定量PCR應(yīng)用領(lǐng)域 

臨床疾病診斷：各型肝炎、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評(píng)價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)育檢測(cè)；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測(cè)實(shí)現(xiàn)遺傳病診斷。

動(dòng)物疾病檢測(cè)：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。

食品安全：食源微生物、食品過(guò)敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測(cè)。

科學(xué)研究：醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究。

應(yīng)用行業(yè)：各級(jí)各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。

 常見熒光定量PCR方法比較 

SYBR Green I 檢測(cè)模式

SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn)：SYBR Green I 的優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)槠淙秉c(diǎn)產(chǎn)生，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對(duì)不同模板不需特別定制不同的特異性探針，通用性較好，并且價(jià)格相對(duì)較低。這對(duì)科研是很有利的，因此國(guó)內(nèi)外在科研中使用比較普遍。

水解探針模式(Taqman探針)

TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團(tuán)連接在探針的 5’末端， 而淬滅劑則在 3’末端。當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí)，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與 3’端的淬滅劑接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí)，聚合酶的 5’外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，發(fā)射熒光。

雜交探針模式(Beacon、FRET)

分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，因此標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團(tuán)產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來(lái)。

能用于實(shí)時(shí)熒光 PCR 定量的方法很多，各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要和當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)條件選擇適合自己的方法。

 實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 

① 應(yīng)該帶一次性乳膠手套并經(jīng)常更換，在試劑準(zhǔn)備室和樣本處理室應(yīng)該配備負(fù)壓式生物安全柜，以防止對(duì)環(huán)境或?qū)悠返奈廴尽?/span>

② 要嚴(yán)格防止氣溶膠交叉污染。采取的措施有：使用一次性帶濾芯移液槍吸頭；不使用吸頭吹打液體進(jìn)行混勻;在生物安全柜中進(jìn)行離心操作；盡量減少在生物安全柜以外開啟試劑或PCR管；禁止在熒光定量PCR結(jié)束后打開PCR管蓋。

③ 實(shí)驗(yàn)中牽涉的有毒有害及有污染的樣本及試劑應(yīng)該嚴(yán)格按照生物安全相關(guān)規(guī)定操作和處理。

④ 熒光探針應(yīng)該避光保存，加入反應(yīng)液后應(yīng)盡快上機(jī)，以防探針粹滅。

⑤ 在進(jìn)行RNA相關(guān)操作時(shí)，必須使用無(wú)RNase的實(shí)驗(yàn)器具及耗材，并加樣后立即上機(jī)操作，以防RNA的降解。

⑥ 所有試劑在開啟之前都要瞬時(shí)離心；試劑配制完成后要瞬時(shí)離心以去除氣泡。

⑦ 不要在熒光定量PCR管上做任何標(biāo)記，不能用手接觸PCR管蓋上采光部位。

菲優(yōu)特檢測(cè)生物團(tuán)隊(duì)擁有專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室、先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)豐富的科研技術(shù)人員。技術(shù)團(tuán)隊(duì)主要致力于基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、生物化學(xué)、病理檢測(cè)、基因檢測(cè)等技術(shù)在科研中的應(yīng)用與推廣。通過(guò)高度細(xì)分、全方位的服務(wù)平臺(tái)，為廣大客戶提供了完善的技術(shù)解決方案和服務(wù)，全程跟進(jìn)，確保滿意。