DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分DNA甲基化通常能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變,從而抑制基因表達,參與多種疾病包括各種腫瘤的發(fā)病機理,DNA甲基化檢測對腫瘤惡性程度的判斷有重要意義。
1)甲基化特異性PCR(Methylation-specific PCR,MSP):亞硫酸氫鈉處理基因組DNA后,所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不變;基于這種堿基的改變,根據(jù)甲基化位點設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR,通過電泳檢測MSP擴增產(chǎn)物,如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段,則說明該位點存在甲基化;反之,說明被檢測的位點不存在甲基化。MSP法檢測具備靈敏度高、快速、簡捷等優(yōu)點。
2)亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP):BSP甲基化測序通過對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理,非甲基化的胞嘧啶被脫氨基而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶,后在PCR反應中尿嘧啶轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶位點保持不變,將PCR產(chǎn)物進行克隆測序,可以分析甲基化發(fā)生的具體情況。該方法實驗結(jié)果準確性高,是甲基化檢測的金標準。
3)高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting,HRM):高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting,HRM)是近年來國外興起的一種全新突變掃描和基因分型的遺傳分析方法。亞硫酸氫鹽處理后,甲基化與未甲基化DNA會存在序列差異,這種差異可通過熔解曲線分析來發(fā)現(xiàn),因為甲基化DNA含有更多的GC,相對更難熔解。根據(jù)熔解溫度及峰型的變化,可輕易區(qū)分完全甲基化、完全非甲基化或雜合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技術可檢出極微小的差別。使用這種方法進行甲基化分析僅需一對引物,相比以往的方法更加快捷、簡便和精確。
實驗流程:基因組DNA提取——DNA質(zhì)檢及定量——亞硫酸氫鈉修飾——DNA修飾純化后回收——引物設計——PCR擴增——甲基化修飾檢測——數(shù)據(jù)分析。
樣品要求:
1)細胞樣品:細胞數(shù)≥106;
2)組織樣品:總量≥0.50;
3)血液樣品:體積≥1mL;
基因組DNA樣品:體積≥20μL,濃度≥50ng/μL。