小動物活體動物體內(nèi)光學成像主要采用生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因(Luciferase)標記細胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等熒光報告基因和FITC、Cy5、Cy7等等。

一、技術(shù)原理

1. 標記原理

活體熒光成像技術(shù)主要有三種標記方法。

① 熒光蛋白標記：熒光蛋白適用于標記細胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP(DsRed)等;

② 熒光染料標記：熒光染料標記和體外標記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以標記抗體、多肽、小分子藥物等;

③ 量子點標記：量子點(quantum dot)是一種能發(fā)射熒光的半導體納米微晶體，是由數(shù)百到數(shù)萬個原子組成的原子簇，尺寸在100nm以下，外觀恰似一極小的點狀物。量子點作為一類新型的熒光標記材料，其在長時間生命活動監(jiān)測及活體示蹤方面具有獨特的應用優(yōu)勢。

與傳統(tǒng)的有機熒光試劑相比較，量子點熒光比有機熒光染料的發(fā)射光強的20倍，穩(wěn)定性強100倍以上，具有熒光發(fā)光光譜較窄、量子產(chǎn)率高、不易漂白、激發(fā)光譜寬、顏色可調(diào)，并且光化學穩(wěn)定性高，不易分解等諸多優(yōu)點。主要應用在活細胞實時動態(tài)熒光觀察與成像，可以在長達數(shù)天內(nèi)進行細胞的分化和世系觀察, 以及細胞間、細胞內(nèi)及細胞器間的各種相互作用的原位實時動態(tài)示蹤。不但如此，量子點還可以標記在其他需要研究的物質(zhì)上，如藥物、特定的生物分子等，示蹤其活動及作用。

2. 光學原理

熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。同生物發(fā)光在動物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在小動物體內(nèi)比藍綠光的穿透性要好得多，隨著發(fā)光信號在體內(nèi)深度的增加，波長越接近900nm的光線穿透能力越強，同時可消減背景噪音的干擾，近紅外熒光為觀測生理指標的最佳選擇。在實驗條件允許的條件下，應盡量選擇發(fā)射波長較長的熒光蛋白或染料。

二、小動物活體動物熒光成像技術(shù)應用領(lǐng)域

1. 腫瘤學

活體熒光成像技術(shù)能夠無創(chuàng)傷定量檢測小鼠的皮下瘤模型。相對于生物發(fā)光成像技術(shù)，活體熒光成像技術(shù)檢測時間較快，只需要不到1s的時間，同時不需要注射底物，節(jié)約了檢測成本。但是需要選擇近紅外熒光檢測深部組織，目前此波段的熒光蛋白種類有限，精確定量較難。

① GFP標記的肺腫瘤模型(H-460-GFP)

H-460-GFP是一個綠色熒光蛋白表達細胞系，它起源于H-460肺小細胞肺癌，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白基因，并由SV-40啟動子起始基因的表達。

通過H-460-GFP皮下腫瘤模型，建立小鼠肺癌的實驗模型，可用來進行有關(guān)抗癌藥物的篩選，可用于測量皮下腫瘤的生長和監(jiān)測對潛在化學治療藥物的反應。

② 量子點標記細胞系

通過量子點可以標記腫瘤細胞，用量子點Qtracker? 705對MDA-MB-231乳腺癌細胞進行標記，皮下接種后動態(tài)觀察其生長以及變化。

2. 抗體

分子探針的一端聯(lián)有能夠和生物體內(nèi)特異靶點結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)(如肽類、酶的底物、配體等)，另一端則是熒光染料。通過Cy5.5標記的抗體的體內(nèi)代謝實驗，可見肝、腎等處的分布。

3. 藥學研究

熒光成像在藥物制劑學研究，尤其是藥物靶向性研究，藥物載體研究中有巨大優(yōu)勢。有關(guān)專家正在設(shè)計用合適的熒光染料標記小分子藥物，觀察藥物在動物體內(nèi)的特異性分布和代謝情況，尤其是中藥研究方面。

應用透射儀從樣本底部激發(fā)光源，可以提高活體熒光成像的靈敏度和檢測的深度。

4. 組織工程

通過發(fā)展EGFP基因表達的細胞系無創(chuàng)傷的評價組織工程的構(gòu)建。通過EGFP標記的組織工程細胞移植到小鼠體內(nèi)特制的支架上，觀察該細胞的生長和變化，從而判斷組織工程的成敗與否。

三、小動物活體成像服務流程

制作動物模型 —— 細胞標記或動物標記 —— 活體成像 —— 數(shù)據(jù)處理

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