熒光定量PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程。隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)也會(huì)相應(yīng)的增加，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度的變化來對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)，并以b-Actin或GAPDH等管架基因作為內(nèi)參照，對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行半定量檢測(cè)。

熒光定量PCR技術(shù)具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍，運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行相對(duì)定量、絕對(duì)定量和定性分析。

菲優(yōu)特檢測(cè)生物將根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對(duì)DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測(cè), 實(shí)現(xiàn)基因的相對(duì)定量、絕對(duì)定量和定性分析。

SYBR Green熒光染料法：適用于任何DNA，無需設(shè)計(jì)探針，采取雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法，實(shí)驗(yàn)周期短，結(jié)果重復(fù)性好，靈敏度高。

TaqMan熒光探針法：經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員設(shè)計(jì)探針，對(duì)目標(biāo)基因有高特異性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，相對(duì)于SYBR Green法，靈敏度更高。

 熒光定量PCR檢測(cè)分類 

1、mRNA表達(dá)量水平檢測(cè)：相對(duì)定量法。

2、MicroRNA表達(dá)量水平檢測(cè)：通過設(shè)計(jì)特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR可以精確檢測(cè)微量樣品中microRNA表達(dá)水平。內(nèi)參基因一般用U6。

3、基因拷貝數(shù)檢測(cè)：如檢測(cè)樣品中不同細(xì)菌含量、基因工程菌目的基因拷貝數(shù)、環(huán)境中耐藥基因檢測(cè)等。采用絕對(duì)定量法。

熒光定量PCR服類容 

1、絕對(duì)定量：

絕對(duì)定量首先必須構(gòu)建與檢測(cè)樣品目的基因具有相同序列的標(biāo)準(zhǔn)品。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作3個(gè)點(diǎn)以上的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知濃度的檢測(cè)樣品進(jìn)行絕對(duì)量(起始拷貝數(shù))分析。

2、相對(duì)定量(mRNA表達(dá)量分析)：

基因表達(dá)的研究一般采用相對(duì)定量的方法。相對(duì)定量法必須對(duì)樣品的目的基因和參比基因內(nèi)標(biāo)同時(shí)分別進(jìn)行定量，然后求出對(duì)于參比基因的目的基因的相對(duì)量。通過對(duì)樣品間的目的基因的相對(duì)量進(jìn)行比較，可以對(duì)不同樣品間的mRNA進(jìn)行表達(dá)量分析。參比基因通常選用表達(dá)量相對(duì)恒定的House Keeping Gene，如：GAPDH、b-actin等。通過同時(shí)對(duì)參比基因的實(shí)時(shí)檢測(cè)，可以對(duì)樣品之間由于起始細(xì)胞數(shù)不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進(jìn)行校正，達(dá)到在嚴(yán)格意義上對(duì)樣品之間的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析之目的。

 熒光定量PCR服務(wù)流程 

總RNA提取及定量 → PCR引物設(shè)計(jì)及反轉(zhuǎn)錄 → 熒光引物設(shè)計(jì)(SYBR Green 熒光染料法)/探針設(shè)計(jì)(TaqMan 熒光探針法) → 熒光定量PCR，進(jìn)行擴(kuò)增曲線、溶解曲線、表達(dá)量差異分析等實(shí)驗(yàn) → 數(shù)據(jù)分析與處理

熒光定量PCR送檢要求

新鮮或保存完好的樣品——細(xì)胞：≥１×１０６，組織≥２０　?ｍｇ，血液≥２００μｌ。組織樣品用液氮速凍后保存于－８０℃，細(xì)胞也可以在加入Ｔｒｉｚｏｌ后保存于－８０℃，后續(xù)樣品需用干冰寄送。樣品需要注意避免各類污染和反復(fù)凍融。

菲優(yōu)特檢測(cè)秉承“科學(xué) · 獨(dú)立 · 誠信 · 高效”的服務(wù)理念，以專業(yè)、專注的態(tài)度為您提供精確的檢測(cè)技術(shù)和咨詢、科研服務(wù)。