蛋白免疫印跡（Western Blot）采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物(NC膜，PVDF膜等)上后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，一抗再與酶標(biāo)記的二抗起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測特異蛋白質(zhì)表達水平。

由于Western blot技術(shù)服務(wù)具有簡便，快捷等特點，所以目前該技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達水平的檢測。

菲優(yōu)特檢測依托青島市生物技術(shù)藥物公共研發(fā)平臺、經(jīng)驗豐富的科研人員、日趨完善的技術(shù)平臺，圍繞蛋白工程、組學(xué)等領(lǐng)域建立了蛋白技術(shù)服務(wù)體系，致力于為廣大科研工作者的研發(fā)項目保駕護航，為您提供價格實惠、品質(zhì)優(yōu)良、快速高效的技術(shù)服務(wù)。

 Western blot實驗步驟 

1、Western blot蛋白質(zhì)提?。焊鶕?jù)實驗?zāi)康牡牟煌x擇不同的裂解液，如RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液，同時根據(jù)蛋白質(zhì)提取組分的不同選擇不同的方法，如提取核蛋白，細(xì)胞質(zhì)蛋白，膜蛋白等。

2、蛋白定量：根據(jù)蛋白質(zhì)的提取條件不同，可采取不同的定量方法，如bradford法、BCA法等。

3、電泳：依據(jù)需要檢測蛋白的分子量選取分離膠的濃度，分別配置分離膠和積成膠，凝膠凝固后進行蛋白質(zhì)上樣和電泳。

4、轉(zhuǎn)膜：可采取半干法和濕法轉(zhuǎn)移，當(dāng)采取半干法轉(zhuǎn)膜時需防止短路：從下到上的順序：濾紙/PVDF膜/凝膠/濾紙/陰極(bio-rad轉(zhuǎn)膜儀)。

5、封閉：5%脫脂奶粉或5% BSA封閉過夜或室溫1小時,孵育時間可根據(jù)實驗需要進行改變。

6、一抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時或4度過夜，孵育時間可參考抗體說明書，并加以優(yōu)化，一抗孵育后TBST洗膜3次，每次5分鐘。

7、二抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時，TBST洗膜3次，每次5分鐘。

8、顯影(ECL法)：將A、B兩種底物按比例稀釋混合均勻后滴在膜上，置于壓片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒進行曝光，曝光一定時間后取出膠片，浸入顯影液中顯影，直到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，掃描膠片和Western blot 圖片分析。

 Western blot實驗送檢要求 

新鮮或正確保存的組織、細(xì)胞或蛋白樣品。

組織樣品：每份樣品約２５０～５００ｍｇ，１０－１５ｍｇ／ｍｌ；

細(xì)胞樣品：每份樣品約１×１０６～１×１０７　細(xì)胞數(shù)，濃度＞１μｇ／μｌ；

蛋白樣品：裂解樣品總蛋白量＞５００μｇ／樣品，濃度≥２μｇ／μｌ。

菲優(yōu)特檢測秉承“科學(xué) · 獨立 · 誠信 · 高效”的服務(wù)理念，以專業(yè)、專注的態(tài)度為您提供精確的檢測技術(shù)和咨詢服務(wù)。